摘要

目的:研究TLR4 asp29gly和MICA外显子5微卫星多态性与撒哈拉以南东非坦桑尼亚村民沙眼严重程度的关系。

方法:采用限制性片段长度多态性(RFLP)和基因扫描技术对样品进行MICA外显子5微卫星和TLR4 299 A/G多态性的基因分型^®,分别。检测TLR4 asp29gly和MICA外显子5微卫星与炎症性沙眼(TI)和倒睫(TI)的关系。

结果:结果显示TLR4和MICA多态性与沙眼疾病的严重程度以及保护有关。TLR4 an等位基因与炎症性沙眼显著相关(p=0.0410)，而G等位基因(p=0.0410)与保护相关。

结论:TLR4和MICA可能通过调节对Ct的免疫反应来调节沙眼疾病严重程度的风险。除了;在对照中增加的MICA-A9杂合子频率可能表明这些等位基因在Ct流行环境的适应中是积极的选择。

关键字

沙眼;沙眼衣原体;炎症;倒睫;单核苷酸多态性;Toll样受体4;微卫星多态性;主要组织相容性复合体(MHC) I类连锁相关基因A;云母

核心提示

Toll样受体4 (Toll like receptor 4, TLR4)和主要组织相容性复合体(MHC) I类链相关基因(MICA)的遗传多态性可能与宿主对沙眼疾病的免疫及其亚临床表型有关。由于MICA和TLR4等位基因在个体间存在差异，可能导致不同的疾病易感性，了解MICA和TLR4等位基因在宿主炎症反应中的重要作用有助于炎症疾病的研究。这些数据表明，携带MICA-A9和asp29gly TLR4 G等位基因的坦桑尼亚人患沙眼病的风险较低。

介绍

沙眼病的特点是革兰氏阴性反复发作衣原体trachomtis (Ct)感染。感染导致慢性炎症和免疫纤维发生过程，导致结膜瘢痕和致盲尖叫[1]。全球8400万个人有活跃的感染;据估计，120万据估计有视觉损害，并且有3％的盲目[2,3]。眼部疾病通过五个阶段进行，其可能与严重程度的增加。这些阶段包括毛囊炎症，卵泡（TF），气管炎症，强烈（Ti），肱骨疤痕（TS），肱骨序列（TT）和角膜透明度（CO）。根据这种分类，前两级TF和Ti代表急性感染，而另外三个等级代表疾病的慢性阶段[4,5]。

长期炎症可导致TS和TT。虽然许多人感染了Ct，但只有3%的人会发生致盲尖叫。此外，大多数感染是无症状的，有证据表明，在感染自行消退后，疾病可能持续数周。这可能提示宿主遗传因素可能在调节对Ct的炎症反应中发挥重要作用，从而决定沙眼疾病的发病机制。潜在的细菌感染免疫应答候选基因是研究其遗传多态性及其与Ct发病机制的关系的理想目标。

主要的组织相容性综合体（MHC）I类链相关基因A（云母）作为用于激活杀伤细胞C型凝集素的受体的配体的重要作用，表达的亚家族D（NKG2D）（天然杀手群2，成员D）受体表达在所有CD8αβT细胞的表面上，γΔT细胞和大多数NK细胞[7]。在正常条件下，云母分子的表达仅限于肠道和胸腺上皮[8]。当云母通过激活NKG2D接合时，后者用作细胞窘迫的信号传感器，并触发一系列免疫反应器机制，包括细胞细胞毒性，细胞因子分泌和细胞增殖[9]。欧洲生物信息学院迄今为止，有101个公认的人云母等位基因和41个不同的MICB等位基因[10,11]。云母基因的外显子5中的微卫星多态性由基于GCT / AGC三联体重复单元的数量（等位基因A4，A5，A6，A7，A8，A9，A10）和另外的核苷酸G /的存在，包括八个等位基因C insertion (allele A5.1) [12-14].Microsatellite polymorphisms of the MICA have been shown to be associated with immunologically-mediated diseases such as the chronic systemic inflammatory disorder Behcet’s disease [15].

toll样受体4 (Toll-like receptor 4, TLR4)是脂多糖(LPS)的模式识别受体[16,17]，已被证明可诱导参与炎症反应的基因表达[18,19]。Ct感染后，细菌LPS与LPS结合蛋白(LBP)结合，并转移到由CD14、TLR4和适配器分子MD2组成的受体复合物。该复合物将启动信号转导级联，通过转录因子核因子(NFκB)[20]释放促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子α (TNF-α)。有报道称，TLR4中的几个单核苷酸多态性(SNPs)通过降低对LPS[21]的亲和力来调节对LPS的响应。上皮细胞通过NF-κB核转位对Ct LPS产生应答，提示信号通路是通过与TLR4和CD14相互作用，导致促炎细胞因子[22]的释放。在人类TLR4基因[23]中已鉴定出29个SNPs。其中，Asp299Gly (rs4986790)多态性已被证明导致人肺泡巨噬细胞和气道上皮细胞[24]对LPS低反应。携带asp29gly TLR4等位基因的个体具有较低水平的促炎细胞因子、急性期反应物和可溶性粘附分子，如白细胞介素6和纤维蛋白原[25]。

鉴于炎症和先天免疫与沙眼感染的发病机制密切相关，而且TLR4和MICA的遗传变异影响先天免疫反应，这项研究的目的是确定TLR4 asp29gly和MICA微卫星多态性是否有助于坦桑尼亚人群沙眼疾病的易感和严重程度。

材料和方法

知情同意在1996年获得免疫遗传的研究符合赫尔辛基宣言,约翰霍普金斯大学的机构审查委员会批准的样品收集在这个研究在约翰霍普金斯大学批准IRB协议从坦桑尼亚沙眼患者免疫原性研究。我们之前发布了来自这些样本[26]的第一组数据。所有被招募的成年患者都要提交一份书面同意书，未成年患者则由其父母或监护人代表签署。

研究参与者

本研究包括两组受试者。第一个是倒睫研究小组(TSG)，其研究对象是从1989年开始的一项关于女性瘢痕和倒睫发展的纵向研究中挑选出来的(n=4932)[27]。1996年，从坦桑尼亚Dodoma地区Kongwa区11个村庄16岁及以上妇女和女孩的人口样本中随机抽取186名感染妇女和186名未感染妇女。在1999年的随访中，感染74例，未感染85例;73%的研究对象在1996年和1999年感染了相同的genovar ompA衣原体。1996年，患有慢性感染的患者更有可能出现倒睫、瘢痕和活动性沙眼[28,29]。共有127份样本，其中122份适合分析DNA。病例为倒睫±炎性沙眼(TI)的妇女和女童(n=21)，对照组为无或轻微疾病(非瘢痕性、非炎性滤泡性沙眼，伴或不伴感染[n=77])的妇女和女童。

在第二组，家庭沙眼研究(FTS)中，选择了来自一个村庄的15个家庭，因为他们的儿童在1年的3个时间点持续感染(先证)(n=15)。OMP.基因分型数据表明，这可能是同一株[30]持续感染或再次感染，提示无法产生保护反应。这些孩子构成了案件。对照组是他们的父母(n=12)和兄弟姐妹(n=40)，他们有轻微或没有疾病(也就是说，父母双方都有毛囊，但没有对照组有炎症、瘢痕或倒睫)。

采用简化的世界卫生组织跗骨结膜临床分级方案对疾病进行分类如下:没有沙眼(TN),≥5毛囊至少0.5毫米每个卵泡沙眼(TF),≥50%的正常深跗骨血管模糊由于炎性增厚的上睑板结膜炎症沙眼(TI±TF)和至少1睫毛接触角膜或最近的证据删除循序睫毛倒睫(TT)[31]。

衣原体DNA

使用先前发表和验证的聚合酶链反应酶免疫分析法检测MOMP-1基因的保守区域C. Thachomatis.跗骨结膜拭子溶化感染[32]。本研究还描述了眼样的采集和处理。每五分之一的PCR样品由现场采样器插入PCR缓冲液的拭子组成。污染率为0.1%。

DNA提取

DNA的提取在之前的出版物[26]中描述。1999年，使用无菌尼龙细胞学刷(Medical Packaging Corp, Camarillo CA)实地从口腔黏膜获得DNA样本。使用这种方法是因为当时外周血单个核细胞很难获得，而且这种方法已被证明适用于不同的遗传分析方法。刷子在颊部表面轻轻旋转，然后放入不同的信封，并钉在参与者的数据表和同意表上。样品在多孔的包膜中干燥，这有助于DNA的保存。将细胞学刷置于0.6 ml 50mm NaOH和0.2 mM EDTA中，80℃孵育10分钟，冷却至25℃。然后轻轻地搅动这些刷子并将其移除以释放DNA。用50µl 1 M Tris-Cl中和样品。为了更长时间的储存，在裂解液中加入等量的90%甘油/水，并在-80°C保存。

为了消除任何悬浮蛋白和rna，所有DNA样品进一步使用QIAamp (Qiagen Inc.， Valencia CA)纯化。简单地说，将400µl保存的裂解液放入含有20µl蛋白酶k的2ml微离心管中，然后在56°C下孵育10分钟，然后在样品中加入400µl乙醇(96-100%)。将上一步取的700µl的混合物置于QIAamp Spin柱上，6000 × g (8000 rpm)离心1 min。将QIAamp Spin柱置于干净的2ml收集管中，将滤液安全丢弃。重复离心步骤后，将500µl的AW1 Buffer加入旋转柱中，6000 × g (8000 rpm)离心1 min。使用AW2 Buffer重复此步骤。在最后一步QIAamp旋转列将被放置在一个干净的1.5毫升微型离心机管的150µl AE缓冲区添加其次是孵化在室温下1分钟,然后离心6000×g (8000 rpm) 1分钟。纯化的DNA是储存在-20°C。

限制性片段长度多态性(RFLP)

从多态性位点两侧设计引物，并在琼脂糖凝胶上按大小区分正常和突变等位基因，筛选出tlr4asp29gly多态性。手术按照Lorenz等人[33]进行。前引物序列被改变，在次要等位基因中产生一个限制位点。以下引物对用于TLR4 asp29gly，正向5“- gattagcatacttagact ACTACCTCCATG-3”，反向5“- gatcaacttctgaaaaagcattcccac -3”。在正向引物中划线的碱基表明核苷酸发生了改变，形成了NcoI (tlr4asp29gly)限制性位点。使用Platinum Taq®PCR试剂盒(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)进行反应。聚合酶链反应(Polymerase chain reaction, PCR)，共33µl (20 ~ 60 ng基因组DNA, 0.5 UTaqDNA聚合酶，每个引物10 pmol，每个dNTP 10 mmol, 50 mmol MgCl₂．反应是在96孔GeneAmp上进行的^®PCR System 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA USA)采用以下条件:为1分钟94°C,那么30 95°C的周期30年代,55°C 30年代,30年代和72°C)。8毫升的PCR产品用于一夜与限制性内切酶消化,并分析了用4%琼脂糖凝胶电泳系统(BMA,大我,美国)确定TLR4基因。

微卫星的云母

为了分析MICA基因TM区微卫星重复多态性，[34]之前的引物描述如下:forward MICAF: 5 ' - ctttttttcagggaaagtgc -3 '和reverse MICA5R:5 ' - CCTTACCATCTC- CAGAAACTGC-3 '。正向引物在5 '端用6-FAM标记(PE Biosystems, Foster City, CA)。PCR反应采用Ampli-Taq Gold试剂盒^®PCR试剂盒(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)。共25µL(5µL, 20 ~ 60 ng基因组DNA, 0.5 U Taq DNA聚合酶，每引物10 pmol，每dNTP 10 mmol, 25 mmol MgCl)进行PCR₂．反应加载在96孔GeneAmp上^®PCR System 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA USA)采用以下条件:为2分钟94°C,那么30 94°C的周期为1分钟,1分钟55°C,和72°C 2分钟。来确定数量的三联体MICAgene TM地区重复,1µl汇集PCR产品混合10µl甲酰胺和变性5分钟在95°C。然后将样品置于冰上至少5分钟，之后将样品装入ABI PRISM 3100(应用生物系统公司，福斯特市，CA USA)。使用GeneScan对ABI 3100产生的数据进行分析^®分析软件。它的算法自动识别和大小每个峰相对于内部尺寸标准，并提供峰面积和峰高信息。导入Gene Scan软件，使用Gene - typer进行筛选^®软件提供最终结果，例如等位基因呼叫和自动桌面建筑。

统计分析

使用SAS/STAT®软件，版本9.1 (SAS Institute Inc.， Cary, NC)进行统计分析。对分类值采用卡方检验或Fisher精确检验，对连续变量采用Student t检验。哈迪温伯格平衡(HWE)是通过使用卡方比较预期基因型频率和观察基因型频率来计算的。对于每个SNP基因型，使用共显性、显性、隐性和对数加性遗传模型进行检验。使用无条件logistic回归模型计算基因型95%置信区间的优势比(ORs)，以估计SNP存在对年龄沙眼风险控制的影响。双侧p值≤0.05为有统计学意义。缺失值的参与者在分析中被省略。使用统计分析软件包R (Lucent Technologies, Murray Hill, NJ)进行遗传建模。

结果

与对照组(TN)相比，TI组(OR=0.63 95% CI: 0.4164-0.9532, p= 0.0520)和TT组(OR=0.53 95% CI: 0.3306-0.8496, p=0.0239)中MICA-A9等位基因具有统计学意义(表1)。

表1:MICA微卫星等位基因与沙眼TI和TT临床表型的关系

当将MICA-A9基因型频率分布与其余MIC-A等位基因进行比较时，我们发现，与对照组相比，它与倒滴虫(TT)的发生显著相关(OR=2.324 95% CI: 1.167 -4.548, p=0.016;表2)。此外，MICA-A9杂合子和纯合子的受试者的相对风险增加。结果显示，在TT患者中MICA A9等位基因缺失时，风险增加了3倍(OR=1.549 95% CI: 1.104-2.017, p=0.016;(表2)表明在种群中具有保护作用。

表2:MICA- A9微卫星在沙眼X的TI和TT临床表型中的基因型频率:A9以外的等位基因。显著p值(<0.05)

炎症性沙眼患者的TLR4 A等位基因频率明显较高(OR=6.350, 95% CI: 1.167-34.538, p=0.0410)，而对照组的TLR G等位基因频率较高(OR=0.160, 95% CI: 0.029- 0.870, p=0.0410;TT患者与健康对照组之间的等位基因和基因型频率无显著差异，而TI组病例中TLR4 A/A显著较高，对照组杂合度较高(表4)。

表3:TLR4 ASP299GLY与坦桑尼亚沙眼的等位基因

表4:坦桑尼亚TLR4 asp29gly基因型与沙眼的关联

讨论

这里提供的数据显示，人类MICA微卫星的外显子5和TLR4 asp29gly的基因组变异与由于感染人类病原体Ct引起的结膜炎症反应有关。致病环境是导致先天免疫系统基因组成改变的进化途径的主要决定因素。TLR4和MICA的多态性就是这些变化的例子，已经与细菌感染的炎症反应生物学相关[35,36]。在人类[7]中，MICA与CD8+ T细胞、gamma delta T细胞和NK细胞上表达的NKG2D激活受体相互作用。已知MICA可以触发NK细胞，并通过与表达在这些细胞上的NKG2D结合，共同刺激一些γδT细胞和抗原特异性αβCD8+ T细胞。在αβCD8 T细胞中，NKG2D/MIC参与提供共刺激信号，补充tcr介导的靶细胞上的抗原识别。Allez等人[37]提供的证据表明，从克罗恩病和炎症性肠病患者分离的肠上皮细胞中，MICA表达显著增加，这表明MICA在应激性上皮细胞的炎症反应中发挥作用。Mei等人[38]研究了MICA等位基因的多态胞外域与导致女性输卵管性不孕症的生殖器Ct之间的关系。数据提示，MICA位点可能改变宿主对Ct感染的炎症反应。在本研究中，MIC-A9等位基因在健康受试者中出现频率较高，提示MIC-A9等位基因具有保护作用。 Mok et al. [39] reported on a possible protective role of MICA-A9 in the susceptibility to rheumatoid Arthritis in Korean subjects. Also, It has previously been reported that the MICA-A9 allele might confer protection from IDDM and celiac disease in the Spanish population [40,41]. This indicates that cells expressing MICA-A9 molecules might be properly recognized by γδ T cells, CD8+αβ T and NK cells, all of which are likely to have a role in overcoming Chlamydial infection and subsequently resolving Trachoma disease.

在不同人群中，编码TLR4胞外结构域结构修饰的多态性[24,42]与细菌感染[43-45]的显著关联，为这一关键的先天免疫信号分子在响应革兰氏阴性细菌感染中的作用提供了强有力的证据。在我们的研究中，发现TLR4 G等位基因具有保护作用(p=0.0410)，而A等位基因在TI表型中具有易感性(p=0.0404和0.0410)。预测模型研究[24,46]表明，该SNP位于TLR4蛋白的结合区域，SNP的遗传会干扰构象变化，可能会改变TLR4与MD2等其他分子的相互作用，这是信号转导所必需的。与A/A纯合基因型相比，TLR4 A/G基因型在炎症性沙眼中具有保护作用。在这项研究中，对MICA-A9杂合子也发现了类似的结果，该结果在坦桑尼亚人群中相对较高，并且随着健康对照组MICA-A9基因型杂合子和纯合子率的降低，风险增加。杂合子优势[47]理论常被用来解释在自然群体中发现的遗传变异，这可能解释了MICA-A9杂合子的保护作用。我们的结果表明，MICA-A9和TLR4 asp29gly杂合度可能在坦桑尼亚沙眼流行的人群中提供选择优势。

综上所述，我们的研究结果提示，MICA和TLR4可能与宿主对沙眼疾病的免疫及其亚临床表型有关。由于MICA和TLR4等位基因在个体间存在差异，可能导致不同的疾病易感性，了解MICA和TLR4等位基因在宿主炎症反应中的重要作用有助于炎症疾病的研究。我们的研究结果表明，携带mica - a9和asp29gly TLR4 G等位基因的坦桑尼亚人患沙眼病的风险更低。进一步研究这些多态性与沙眼Ct感染炎症反应活性调控机制的结构功能关系。

作者的贡献

MA:撰写论文并进行分析。

MK、AR、VA、PF-H、HB对数据进行分析。

本研究由GD、NB、TQ设计。

由

国家卫生研究院/国家过敏和传染病研究所拨款RR03048;国家卫生研究院/国家研究中心资源基金2G12RR003048;以及华盛顿特区霍华德大学的非洲侨民国家人类基因组中心。

院校检讨委员会声明

这项研究得到了约翰霍普金斯大学机构审查委员会的批准。

知情同意的声明

根据《赫尔辛基宣言》，1996年获得了免疫遗传学研究的知情同意。

致谢

作者感谢Harran Mkocha和孔武沙眼工程，为野外组成部分和弗吉尼亚特纳和Sidney Katala组装女性队列的原始Trichiaisis，也非常感谢Gaurav Tripathi和Abubaker Sidahmed为他们的稿件评论。

利益冲突

没有披露

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条信息

文章类型:研究文章

引用:Abbas M，Berka N，Khraiwesh M，Ramadan A，Victor A等人。（2016）TLR4和云母的遗传多态性与坦桑尼亚的沙眼疾病的严重程度有关。AutoImmun Infec Dis 2（3）：DOI http://dx.doi.org/10.16966/2470-1025.116

版权:©2016 Abbas M.这是一篇基于创作共用署名许可条款发布的开放获取的文章，该条款允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。

出版的历史:

收到日期:2016年5月3日

接受日期:2016年5月25日

发表日期:2016年6月3日