抽象的

口蹄疫(FMD)是对畜牧业最重要的经济威胁。口蹄疫的爆发可能对牲畜生产和贸易造成毁灭性影响，给农业部门造成重大经济损失。因此，在国际上实施了疫苗接种和控制计划，以最大限度地减少FMDV的传播。自2012年以来，格鲁吉亚实施了国家免疫规划，每年两次为大型反刍动物(LR)和小型反刍动物接种三价(A, O, Asia1)疫苗。然而，积极的血清监测监测仍然显示该病的高血清流行率，表明病毒的传播。在这项研究中，我们试图估计不同血清型FMDV在格鲁吉亚不同危险地区的流行情况。共检测了4991只大小反刍动物的血液中是否存在FMDV非结构蛋白(NSP)，并通过基于结构蛋白(SP)的检测进一步研究阳性动物的确切血清型。结果表明，接种疫苗的动物感染口蹄疫的比例显著(6.6%)，阳性动物通常感染一种以上的口蹄疫血清型。因此，我们的数据呼吁在格鲁吉亚实施更严格的口蹄疫疫苗接种和监测计划，特别是考虑到格鲁吉亚的地理位置，口蹄疫的存在可能对过境产生重大影响，也可能对其他国家构成威胁。

关键字

口蹄疫;病毒;Serosurveillance;风险区域;乔治亚州

介绍

畜牧生产是经济落后国家的重要经济来源。动物疾病可对畜牧业的潜力和安全产生重大负面影响，而这反过来又可对营养、公共卫生、稳定和粮食供应产生广泛影响。口蹄疫(FMD)是最重要的跨界动物传染病。如果暴发口蹄疫，由于牲畜生产力和贸易的降低，有可能造成巨大的经济损失[2,3]。

口蹄疫病毒(FMDV)在免疫上有7种不同的血清型:A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia 1，由小核糖核酸病毒引起的单链核糖核酸(ssRNA)属阿夫虫病毒。口蹄疫宿主范围广，具有高度传染性和病毒容易传播的能力，使该病具有非常重要的意义[4]，这一切都与病毒容易达到流行水平[3]的固有能力相结合。

此外，FMD是恐怖袭击的潜在候选人之一，这是全球范围内的一个重要关注[5]。疾病会导致系统性感染，影响具有高死亡率的广泛野生动物和家畜。它在亚洲，中东，非洲和南美洲的许多国家（世界动物健康组织（OIE），2019年）[6]是流行的[6]。

尽管存在彻底的疫苗接种计划，但我们的机构（农业国家实验室，格鲁吉亚）进行的一年一度的血清训练运动检测到格鲁吉亚的FMD的相对较高的Seroprevalence率，特别是沿着土耳其，亚美尼亚和阿塞拜疆的边界（数据）未显示）。这是一个非常紧迫的问题，根据牲畜出口，大量的格鲁吉亚GDP [7]。乔治亚州的最后一次爆发发生在2002年在Samtskhe-Javakheti地区，近年来没有报告临床病例;但是，如果重新提出，FMDV可以在全国各地容易地分布，因为动物被移动到活动物市场，或在季节性迁移期间。

在这项工作中，我们展示了整个格鲁吉亚的FMDV血清监测结果。本研究的目的是确定口蹄疫病毒在不同危险区的传播情况，以评估口蹄疫防控措施。本文采用检测FMDV非结构蛋白(NSP)抗体(Ab)水平的方法来判断病毒的传播情况。因为NSP特异性抗体只在病毒复制过程中表达，被认为是感染的标志;对所有7种FMDV血清型都很常见。

此外，过去几年未对在格鲁吉亚流行的FMDV血清型进行调查。因此，我们也调查了每个血清型:O型、A型和Asia 1型在NSP-Ab阳性动物中的血清流行率，这三种血清型是该地区已知存在的。格鲁吉亚境内FMDV血清流行率及其血清型的详细地图将有助于指导实施更好的FMD控制做法，并最终提高动物出口的经济生产力。总而言之，我们的目标是:(A)估计病毒传播水平;(B)提供有关口蹄疫流行血清型在不同地区分布的初步背景资料;(C)对格鲁吉亚不同畜牧部门和地理区域的口蹄疫感染危险因素进行分析。

论文的其余部分首先介绍了所使用的方法，包括取样和测试程序。结果如下，讨论和结论在文本的最后。

材料和方法

抽样地点及样本量计算

2017年，我们在格鲁吉亚开展了广泛的FMDV非结构蛋白(NSP)血清学监测活动。经过与该领域专家的广泛磋商，我们决定根据四个风险区域(R1-R4热点，图1)对样本进行分层:

图1:风险热点用于FMDV血清训练抽样。（a）具有高风险村庄的区域，R1风险热点。（b）带有低风险村庄的区域，R2风险热点。（c）迁移动物区域，R3风险热点。（d）候选地区，R4风险热点。

•乔治亚州高风险(R1)和低风险(R2)的村庄(不包括候选区域- lr)被视为指示动物。

•东乔治亚州的迁徙动物(R3)-只有个别耳朵被标记的SR动物被作为指标;

•在候选区域(R4)， FMDV预计不会出现的村庄，调查lr和SR。

高风险和低风险类别的村庄

采用两阶段抽样设计，即首先抽样村庄，然后确定在村庄内进行试验的动物数量。

一是建立了动物数量接近的区、区村名录，总数达到80万头。根据2015-2016年进行的一项血清调查的结果(数据未公布)，格鲁吉亚每个村庄被划分为“高”和“低”风险类别。特别是，高危类别包括S. Javakheti、K. Kartli和Kakheti地区所有有活动物市场的村庄，以及有季节性迁徙路线的其他村庄。低风险类别包括所有其他村庄。高风险村和低风险村的预期FMDV患病率分别设定为15%和10%。

排除了少于50只动物的村庄，导致高风险的788个村庄和1642个村庄，为血清调查选择的低风险类别。使用Winepi在线工具的“估计百分比”，www.winepi.net [8]，使用95％的置信水平和6％接受错误来计算每个类别的村庄的最终数量。这导致为低风险类别选择117个高频和91个村庄的村庄。

使用WinEpi在线工具的“疾病检测”功能，计算每个村庄的采样动物数量。设定95%置信水平，人口规模(N)为80万，预期患病率为20%，结果在每个村庄检测14个样本。

因此，每个风险类别的总规模为高危类别的1638个样本(117 * 14)，低风险类别的1274个样本(91 * 14)。每个风险类别内的两个村庄和每个村庄内的动物都是随机选择的。

乔治亚州东部的迁徙动物(小反刍动物)

迁徙动物被认为是另一种风险类别。迁移的动物大部分是SR，因此本次采样只包括SR动物。采用两阶段抽样设计，首先确定牧群数量，然后确定每个牧群内的样本数量。

样本框架包括格鲁吉亚东部所有迁移的SR畜群。创建了一个畜群列表(分配给村庄)，拥有大约数量的动物，总数最多为500000SR。为了统计上的稳健性，将SR小于50的牧群排除在调查之外。这导致了总共170个畜群。

使用WinEpi的“样本量/估计百分比”函数确定牧群数量，采用95%置信水平，预期患病率为11%，可接受误差为6%，共检测65个牧群。利用WinEpi的“疾病检测”功能，计算每个畜群内可检测的动物数量。设定95%置信水平，预期患病率为25%，人口规模为50万(N)，结果为每个牧群提供11个样本。因此，总样本设为715只(65 * 11)动物。兽群和兽群中的动物都是随机选择的。

候选地区的村庄

Racha、lechkhumm - kvemo、Svaneti和Mestia区域被认为是进进控制通路第3阶段的候选区域[http://www.fao.org/ag/againfo/commissions/docs/pcp/pcp26012011.pdf]，即不再需要采取积极策略根除口蹄疫的区域。

在这种情况下，采用了两阶段抽样设计，首先确定村庄的数量，然后确定每个村庄内要测试的样本数量。建立了每个地区的村庄名单，其中大约有动物数量，总共有26170个LR和1786个SR。为确保统计数据更可靠，调查将牲畜少于50只的村庄排除在外。使用WinEpi“样本大小”函数来计算最终要包含的村庄数量。通过设置95%的置信水平、5%的可接受误差、16%的预期患病率和184个村庄的初始数量，结果有98个村庄。同样，WinEpi的“疾病检测”功能通过考虑95%的置信水平、21000总人口规模和20%的预期患病率，确定了每个村庄应该选择14个样本。因此，总样本量设为1372只(98 * 14)。随机选择村庄和村庄内的动物，按各地区/村庄/农场的比例检测LR和SR。

血清学检测

作为畜牧业面临的最重要的经济威胁，需要对FMDV进行可靠的检测，以授予动物无病地位，并确保国际贸易安全。根据国际兽疫局(OIE)的规定，病毒中和试验(VNT)是抗体检测的国际标准，但目前已有酶联免疫吸附试验(ELISA)，它们可以在生物安全级别(BSL) 2实验室进行。

FMD - id筛选FMD NSP竞赛中NSP抗体的检测

我们用了这个ID。ELISA检测所有易感物种血清和血浆中抗FMDV 3ABC非结构蛋白(NSP)的特异性抗体。本试验采用FMDV NSP包被ELISA板检测NSP特异性抗体。我们在所有应用中都遵循生产商的说明:每个井中分配50µl的稀释缓冲液，以及30µl的阳性对照、阴性对照和测试样品。37℃孵育2小时;孵育后，将孔中的内容物倒空，用300µl洗涤液洗涤5次。下一步是将100µl的偶联物分配到每孔上，然后在21°C下孵育30分钟。随后，重复洗涤步骤，配取100µl底物溶液，在21°C孵育15分钟。为了终止反应，加入100µl的终止液，在450nm处读取结果。

如果样本中存在抗nsp抗体，它们会形成抗原-抗体复合物，掩盖病毒的抗原表位。被分配的抗nsp辣根过氧化物酶(HRP)结合物固定在剩余的游离表位上，形成抗原结合物-HRP复合物。洗涤步骤去除所有多余的共轭物，并在基质溶液(TMB)分布后出现显色。显色强度与检测样品中NSP特异性抗体的含量成反比。在没有抗体的情况下，出现蓝色溶液，加入停止溶液后变成黄色。在有抗体的情况下，未观察到染色。

如果负控制OD（ODNC）的平均值大于0.7（ODNC> 0.700），则测试是有效的，阳性控制OD（ODPC）的平均值小于ODNC的30％（ODPC / ODNC <0.3）。结果解释是通过计算竞争百分比（S / N％）进行的，这是针对公式计算每个样本的结果：

S/N%=OD样品/ ODnc × 100

竞争百分比小于或等于50%的样品被认为是积极的，否则是消极的。

Priocheck FMDV型特异性ELISA试剂盒

Priocheck FMDV型特异性阻断ELISA是一种商业可用的检测方法在体外偶蹄动物血清中抗亚洲口蹄疫病毒1型、A型和O型抗体的检测该测试证明了良好的可靠性，并由FMD世界参考实验室进行了评估。微滴度板分别涂布非传染性口蹄疫病毒O型、A型或亚洲1型抗原。特异性单克隆抗体与FMDV型特异性抗原的反应被检测血清样本中出现的特异性抗体阻断。

对于实验室程序，我们按照制造商的说明进行。将80µl ELISA缓冲液、20份血清、阴性对照、弱阳性对照和阳性对照(o型参考血清1 ~ 4)分别放入相应的孔中。室温(22℃)孵育60min，用300µl洗涤液洗涤6次。加入100µl AbHRPO偶联物，22℃孵育60分钟。用300µl洗涤液再洗6次，每孔加入100µl显色剂(chromogen, TMB)底物。然后是孵育步骤(15分钟，在22°C)。加入100µl停止显色液。在450nm处测量光密度(OD)。

A类和亚洲1的结果计算和解释:

阴性对照的平均值=OD450 max

计算弱阳性对照、阳性对照和试验血清的抑制率(PI)为:

PI=100-(OD450测试样品/OD450 max) × 100

PI≥50%为阳性;PI <50%的样本被认为是阴性。

如果OD450 max至少为1.000，则测试有效;弱阳性对照的平均PI为>50%;阳性对照的平均PI为A型>70%，亚洲1型>75%。

对于O型血，首先通过减去参考血清1的平均值来校正所有OD值。然后计算参考血清4的校正OD值的平均值(校正OD450 max)。最后计算PI值为

PI=100-(校正OD测试样品/校正OD450 max) × 100

PI≥50%为阳性，PI < 50%为阴性。

如果修正的OD450 max至少为1.000，则测试有效;2>的平均PI为60%;参考血清3的平均PI <40%

FMDV血清型(O, A, Asia 1)特异性抗体固相竞争ELISA (SPCE)

固相竞争酶联免疫吸附试验(SPCE)是一种简便、快速的血清学检测方法。提供了一种可随时使用的测试方法，适用于大规模调查，可在生物安全二级实验室采用;SPCE ELISA检测具有血清型特异性，可检测任何易感物种FMDV感染动物血清或血浆样本中存在的抗体。

检测微孔板用同源单克隆抗体(MAb)捕获的FMDV灭活抗原(O型/ A型/ Asia 1型)预包被。将稀释后的样品(1/10、1/30、1/90、1/270)在室温下孵育60分钟，使样品中的特异性抗体最终与各自的抗原结合。25µl anti-FMDV O型(或亚洲1)马伯,与过氧化物酶共轭分布直接洗涤步骤,其绑定的将抑制同源抗原抗体阳性血清之前绑定到病毒,而在例阴性血清共轭马伯可以与FMDV灭活抗原发生反应。用200µl清洗井4次。通过洗涤除去多余的共轭物，将50µl的底物溶液分配到所有孔中(在室温下孵育20分钟)。如果结合的MAb与病毒结合，即测试血清为阴性，则会发生比色反应，而阳性血清抑制显色。加入50µl/孔止液终止反应，封后在450nm处读取每孔的光密度(OD)。

阳性对照血清和试验血清的抑制率(PI)计算如下:

%抑制率(PI)=100-(血清OD/参考OD *) × 100

*参考外径=阴性对照4孔外径的平均值

测试程序的有效性是通过精确的标准来评估的:

O型和Asia 1型阴性对照井的OD值必须≥1.0，而A型的OD值应≥0.8

对所有三种血清型，阳性对照在1/10稀释时的抑制率≥90%，>在第二次稀释(1/30)时的抑制率为50%。

结果解释如下:在1/10稀释倍数下产生抑菌≥70%的样品为阳性，否则为阴性。第二次稀释(1/30)评估抗体水平:强阳性血清在1/10和1/30稀释时抑制≥80%，而在1/10稀释时抑制≥80%，在1/30稀释时抑制≤50%的血清通常被认为是低阳性。阳性血清的终点滴定度对应于产生50%抑制的最高稀释度。

统计分析

我们按照分析解释标准分别对每个试验的结果进行解释。与epiR R包中实现的一样，使用正态近似[9]计算比例的置信区间。一个χ²使用霍尔姆校正的检验来比较不同的比例，如R函数成对执行。道具。测试[10]。所有统计分析采用R统计软件进行，地理信息系统(GIS)制图采用ArcGIS version10.1。

结果

FMDV seroprevalence

从4991只大小反刍动物中采集大小反刍动物样本，用于检测NSP流行情况。只收集4-18月龄的动物，超过这个合适年龄范围的动物被排除在分析之外。表1报告了样本和数据收集的详细信息。在371个村庄共抽样4991只动物。这一数字包括来自对迁移路线感兴趣的村庄的715只小反刍动物，其余动物来自高/低风险地区和候选地区村庄的反刍动物。

风险热点		预期的村庄/牧群流行率	许多村庄	期望个人患病率	样本数量	样本总数
乔治亚州的村庄，不包括候选地区	高风险类别	15	117	20.	14	1737
	低风险类别	10	91			1191
东乔治亚州的迁徙动物		11	65	25	11	715
候选地区的村庄		16	98	20.	14	1348
总计			371			4991

表格1：血清监测数据收集的详细情况。对于每个风险热点，从左到右报告了以下信息:村一级的预期患病率、抽样村数、个体动物水平的预期患病率、每个村抽样的目标动物数量和最终抽样动物数量。

4991只动物中327只阳性(6.6%)。尤其是,1737只动物被收集在高风险地区191份阳性样本(11%),1191年与89年在低风险区域积极样品(7%),715个样本收集小反刍动物的迁徙动物的区域(3%)、18阳性样本和1348年候选样本地区29个阳性样品(2%)。表2报告了每个风险热点的详细结果。

风险热点	测试	积极的	估计％	低%	上%
风险1-高风险区LR	1737	191	11	9．6	12．5
风险2-低风险区域LR	1191	89	7．4	6．1	9．1
风险3-迁徙动物	715	18	2.5	1.6	3．9
风险4-候选区域LR/SR	1348	29	2.1	1.5	3．1
总计	4991	327	6．6	5．9	7．3

表2：血清流行率检测结果:对每个风险热点报告检测和阳性动物的数量，以及估计比例及其95%置信区间。

正如预期的那样，阳性动物的患病率在高次村（风险1Hotspot区）比任何其他区域（在所有比较中调整的P值<0.01）更高。此外，在候选地区迁移动物和村庄（风险4个热点区域，P值：0.707）之间没有统计学上没有患有患有统计学意义的患病率。

FMDV血清型分布

所有动物已成为积极的从该规划的测试,这是决定随机选择140个样本进行进一步调查每个FMDV的血清型分布(类型啊,和亚洲1)。图2表明,这些动物是起草从属于所有风险热点地区除了候选区域。所有选择的动物均进行了固相竞争酶联免疫吸附试验(SPCE)和Priocheck FMDV型特异性阻断酶联免疫吸附试验。图3报告了根据两种试验对每种血清型呈阳性的动物数量。Priocheck检测血清A型81只，Asia 1型92只，O型90只。相反，SPCE检测检测出125、113和128只血清型相同的阳性动物。大多数样本的结果是一个以上的血清型阳性，因此总数不等于140。此外，Priocheck测试似乎比SPCE测试更敏感。

图2:格鲁吉亚各地区随机抽取了140个FMDV阳性样本，以评估每种血清型的患病率。

图3:结构蛋白(SP)筛选结果。对于每一种检测血清型(O, A, Asia 1)， SPCE和Priocheck检测都报告了140个阳性样本的数量。

图4报告了每种血清型和混合血清型感染的动物数量。大多数动物(113个样本)三种血清型均呈阳性;A型和O型感染10例，亚洲1型不感染;5只动物O型阳性，2只动物A型阳性。

图4:不同FMDV血清型的混合感染(根据PRIOCHECK试验)。主条形图(灰色条形):每种血清型组合报告的感染动物总数。侧边条形图(蓝色条形):每种血清型阳性动物的数量。

讨论和结论

在这项工作中，我们调查了格鲁吉亚FMDV及其三种血清型的血清流行率。格鲁吉亚控制口蹄疫的动力是向阿拉伯国家出口羊，这是格鲁吉亚经济收入的重要来源。格鲁吉亚有若干免疫预防程序和若干口蹄疫控制策略。首先，在2013年夏天，格鲁吉亚成为欧洲控制口蹄疫委员会(EuFMD)的成员国。目前的口蹄疫控制计划包括口蹄疫积极监测、跨境活动、使用电子系统进行动物健康监测、动物鉴定和登记以及迁徙动物监测。口蹄疫控制计划包括疫苗接种运动，以采取预防口蹄疫的措施。采用三价(A、O、Asia1)疫苗接种，每年两次覆盖LR和SR的全部人口。然而，确保所有这些程序的最佳执行是一项具有挑战性的任务，任何偏差都为疾病的传播提供了一个边缘。

关于本研究的监测活动，应该注意的是抗原(Ag)和抗体检测试验均可用于识别口蹄疫病毒血清型。病毒及其产物只能在相对较短的时间内被检测到，相比之下，动物体内的抗体可以持续数年，指出当前或过去的感染情况。因此，我们选择抗体估算作为首选的监测方法。特别是，我们更倾向于酶联免疫吸附试验(ELISA)，酶联免疫吸附试验更简单、更快，适合大规模实验，它是用灭活病毒进行的，因此可用于生物安全二级实验室(世界动物卫生组织(OIE)， 2019)[6]。

我们的结果强调了与格鲁吉亚FMDV的Seroprevalence相关的几种有趣现象。首先，尽管近年来缺乏临床案例，但塞开修仍然是相关的，但4991只测试动物的6.6％是FMDV阳性。在高风险下考虑的区域有效地显示了统计学上显着高于所有其他热点中测量的患病率的血清透析（11.0％）。与此同时，预期没有或最小的FMDV存在的候选区域具有最低的SEROPREVALING（2.1％）。最后，所有风险热点都有一个更低的普遍性，专家确定为期望（在表1中报告）。

当涉及到特定血清型的检测时，我们注意到PrioCheck试验比SPCE试验具有更高的敏感性(图1)。最重要的是，大多数被测试动物对所有三种血清型均呈阳性，表明合并感染的程度非常高。

有很多原因可以解释我们的研究结果:

1.邻国每年爆发疾病:土耳其、亚美尼亚和俄罗斯联邦是格鲁吉亚疾病传播的危险因素之一[11]。考虑到该病原体的高度传染性，以及由于国家边境之间的牲畜无法控制的流动，如果在附近地区发生疫情，感染很容易跨越边境传播。此外，在冲突地区也有不受控制的动物活动领土。所有这些问题都可以解释这种疾病的高血清流行率，特别是在与土耳其、亚美尼亚和阿塞拜疆接壤的村庄。

2.动物迁徙是格鲁吉亚农业的典型特征。动物在冬夏牧场之间迁徙。动物在季节性牧场的自由迁徙以及动物饲养的多样性(动物不在封闭的农场饲养)极大地增加了疾病的传播。当迁徙动物与当地动物接触时，口蹄疫传播风险增加。

3.与动物迁徙有关的另一个风险因素是LR和SR的大型开放活市场的存在，在这些市场中，感染很容易在来自不同地区的动物之间传播。

4.疫苗接种活动是国家预算所涵盖的高成本和资源密集型计划。由于成本高，并非所有动物都收到合适的增压疫苗。不同的FMDV血清型之间没有交叉保护。FMD高血清伪装的越来越多的原因可能是有限的疫苗效果。根据政府法规，疫苗的选择是盲目的，在很大程度上取决于产品价格，可能有些可能导致收购次优的准备。

这项研究的结果将有助于未来的研究，因为关于格鲁吉亚血清型流行率的信息在该领域仍然是一个空白。特别是，格鲁吉亚的疫苗选择不是基于任何相关研究或FMDV血清型疫苗匹配，疫苗的类别在很大程度上影响疫苗接种计划的效力。未来的研究应侧重于通过PCR检测抗原、病毒分离和测序，更好地鉴定在格鲁吉亚流行的FMDV血清型。为了找到合适的疫苗株，必须进行抗原匹配试验。特别是，我们正在考虑在6个月内进行小规模的疫苗匹配和疫苗接种后抗体水平评估试验。该实验将为我们提供适当的疫苗和接种后免疫的信息，因为接种活动的有效性很大程度上取决于选择的疫苗[12]的质量和适用性。

总之，在这项工作中，我们确定了格鲁吉亚不同危险地区的FMDV血清流行率。特别地，我们评估了FMDV非结构蛋白抗体水平作为感染的标志。我们进一步研究了该地区已知的三种FMDV血清型，即A型、O型和Asia 1型。

我们的结果有助于了解在格鲁吉亚流行的口蹄疫血清型，并将有助于指导实施更好的口蹄疫控制做法。格鲁吉亚国内生产总值(GDP)的很大一部分是基于牲畜贸易，控制口蹄疫的流通和传播将直接影响格鲁吉亚的经济地位。未来的研究应侧重于实施更多的实验室诊断方法，这将提高实验室检测的质量，但更重要的是，有助于指导关于口蹄疫疫苗接种计划的政策决定，以及更好地控制格鲁吉亚口蹄疫的措施。

确认

这项拨款是根据广泛机构公告(BAA) HDTRA1-14-24-FRCWMD-BAA，研究和发展企业，基础和应用科学理事会，打击大规模杀伤性武器基础研究(C-WMD)，国防威胁减少局(DTRA)授予的。我们感谢格鲁吉亚国家粮食署的合作。

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条信息

文章类型：研究文章

引文：Toklikishvili N, Tchigitashvili T, Turmanidze M, Tigilauri T, Mamisashvili E, et al.(2020)格鲁吉亚高危地区动物口蹄疫病毒血清型的比较鉴别。中国科学(d辑:地球科学

版权:©2020 Toklikishvili N，等。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可协议的条款下发布，该协议允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。

出版的历史:

收到日期:2020年11月16日,

接受日期:11月30日，2020年11月

发表日期:2020年12月04