摘要

致病性微生物污染孵化蛋会降低孵化率，并可能造成工业禽鸟生产的经济损失。本研究的目的是评估一个商业鸵鸟养殖场的微生物状况及其与孵化管理的关系。微生物取样做了两个死胚胎的器官,泄殖腔七刚孵出的小鸡,一个成熟的雌性鸵鸟,五个不育的内容鸡蛋,孵化室和孵化机,饮食的成分,和62个鸡蛋的外壳表面在生殖季节。采用MacConkey琼脂、血琼脂、Sabouraud’s dextrose琼脂、营养琼脂、PPLO琼脂等多种选择和差异培养基对微生物进行分离鉴定。虫卵壳表面发现不同类型的真菌和细菌污染，其中革兰氏阳性杆菌占74%(46/62)。来自两个死亡胚胎的器官革兰氏阳性杆菌，革兰氏阳性球菌，葡萄球菌epidermidis，rhodotorula spp。，Helminthosporium spp,曲霉属真菌nidulans是孤立的。饮食中的大部分成分都含有粘稠和广泛的细菌种类。最后，通过McNemar试验评价了甲醛气体的应用效果，结果表明，在高污染率下，该方法对降低蛋壳的微生物负荷非常有用。通过对死胚和蛋壳表面分离出的微生物群落的比较表明，养殖场不同部位的微生物可能会导致鸡蛋的污染，并渗透到鸡蛋中。因此，建议对孵化蛋实施卫生消毒，以提高孵化率。

关键字

细菌和真菌污染物;死胚;蛋壳;孵化

介绍

说明繁殖性能主要组成部分的两个基本因素是可育性和孵化性[1]。鸡的育性和孵化率的遗传力估计在0.06 ~ 0.13之间，说明非遗传因素对这些性状的影响较大。影响孵化率的因素可以引用为鸡群的条件(年龄、健康、营养和品系)，以及蛋的条件，如质量、卫生、季节、大小、贮存时间和重量[3,4]。

由于鸵鸟肉、羽毛、皮革和蛋[5]等产品的重要性，人们越来越重视鸵鸟养殖。为了从养殖场获得足够的利润，需要生产高孵化率的蛋。鸵鸟人工孵化的孵化率明显低于家禽业，最高可达60%左右，平均[6]。有报道称，鸵鸟卵在人工授精过程中孵化率低与卵[7]的微生物污染有关。通过对来自9个养殖场的320个鸵鸟蛋的研究，发现平均22.8%的被检蛋微生物污染[8]。

与此同时，据报道，禽蛋的污染平均为13%[9]。鸵鸟蛋的微生物污染高，在孵化过程中失重率高，表明鸵鸟蛋壳[8]中存在如此多的气孔。产卵后，蛋壳表面被微生物污染。如果环境条件适宜，它们可以迅速复制，并通过壳孔渗透到卵内。最终，鸡蛋的污染会导致胚胎[10]的死亡。一些真菌和细菌，如假单胞菌，可以分解角质层。角质层的破坏，可能会使更多的微生物进入卵内，使更多的水分从卵内流失[10,11]。

有报道称，使用无菌卵可增加孵化卵数。因此，为了确定鸵鸟蛋的污染来源，我们试图分离和鉴定在一个商业鸵鸟养殖场和孵化场的不同部位可能污染鸵鸟蛋的微生物制剂，在一个完美的孵育前。

材料和方法

农场规格

在伊朗Alborz省的mohas®鸵鸟养殖场进行了微生物污染调查抽样操作。该农场位于相对温暖和干燥的地区，总数量约为100只黑颈鸵鸟(Struthio camelus南极光)．在北半球，鸵鸟的繁殖季节为3月开始，8 / 9月左右结束，因此，对这一时期的部分蛋进行了微生物污染的随机研究。

在该农场，每只产蛋鸡每月平均产9个受精卵左右。鸡蛋在放入孵化机之前先用刷子清洗。农场经理认为，“鸵鸟蛋是在沙巢中产下的，不需要消毒，鸵鸟是一种抗病鸟类。”农场有两台播种机和一台孵化机。在繁殖季节开始前，对孵化场和舍鸟进行了清洁和消毒。在孵化期间，在孵化室入口前放置了一个消毒池。

蛋壳抽样

为调查鸵鸟蛋的微生物污染情况，采用无菌塑料袋采集鸵鸟蛋62枚，无菌塑料袋不与手直接接触。采用Deeming DC[8]程序进行细菌分离和鉴定。采集鸵鸟卵表面，在麦康凯琼脂、血琼脂、Sabouraud’s葡萄糖琼脂、营养琼脂和PPLO琼脂上培养。然后将10只鸡蛋用甲醛气体在密闭容器中熏蒸20分钟，再次进行微生物分离鉴定。

环境采样(孵育室:空气和地面)

将含有麦康凯琼脂、血琼脂、Sabouraud’s葡萄糖琼脂和营养琼脂的若干培养皿置于孵育室、setter和孵卵器中15分钟。然后，它们被密封并转移到实验室进行微生物培养。同时，用拭子对进风口和出风口进行取样，并将其送到实验室[14]。

死亡胚胎和不孕卵子取样

孵化第38天，当卵转移到孵卵器时，用蜡烛将卵点燃，选择5个不育卵和2个死亡胚胎卵，用无菌袋运送到实验室，并用钻头刺穿。将其混合后采样，在麦康凯琼脂、血琼脂、Sabouraud’s葡萄糖琼脂、营养琼脂和PPLO琼脂上培养。在两个死亡的胚胎中检测到微生物污染。标本采自肺、肝、肠、眼、卵黄囊和心脏，无菌。最后在麦康凯琼脂、血琼脂、沙波洛葡萄糖琼脂、营养琼脂上进行培养Salmonella-Shigella琼脂(15、16)。

泄殖腔取样

七个新孵出的雏鸡和一个成熟的雌性鸵鸟随机取样，随机用湿棉签采样，并在硒肉汤中培养标本，在24小时后培养Macconkey琼脂和Salmonella-Shigella琼脂[17]．

抽样的饲料

以豆粕、苜蓿、麦麸、骨粉、玉米、大麦和混合饲粮为试验材料，测定饲料微生物污染程度。样品装在经过消毒的聚乙烯袋中，然后转移到实验室。每个样品加25克到225毫升乳糖汤中(稀释为1:10)。然后加入生理盐水配制成1:100、1:1000、1:100 000的稀释剂。将所有稀释物各0.5 mL置于营养琼脂培养基上培养。0.1和0.01的0.5 mL稀释液在MacConkey琼脂和Sabouraud’s dextrose琼脂[18]上培养。

抽样的水

取样调查了农场水的微生物污染情况。一个样品被转移到实验室测量pH值和水的硬度。采用[19]培养基，分别用麦康凯琼脂、血琼脂、Sabouraud’s葡萄糖琼脂和营养琼脂培养，对农田水的微生物污染进行鉴定。

微生物培养物

取样后，他们被转移到Razi疫苗和血清生产研究所(Karaj-Iran)微生物系实验室，并使用微生物培养来确定微生物的类型。需氧培养，在含5%二氧化碳、37℃的环境中过夜;并在微流厌氧系统柜中进行厌氧培养，在37℃下提供10%二氧化碳、10%氢气和80%氮气的气氛中培养48小时。

营养琼脂是一种培养基，用于微生物的培养，支持广泛的不挑剔的有机体的生长，可以生长各种类型的细菌和真菌。它含有细菌生长所需的许多营养物质。血琼脂用于培养那些生长缓慢的细菌或微生物，例如链球菌引起的肺炎和奈瑟氏菌属物种。它能检测和鉴别溶血细菌，特别是链球菌是一种鉴别介质，用于检测某些细菌分泌的溶血毒素，如某些菌株杆菌，链球菌，肠球菌，葡萄球菌,气球菌属．沙波罗氏葡萄糖琼脂适合培养皮肤植物和其他类型的真菌和丝状细菌，如诺卡氏菌属．麦康凯琼脂是一种细菌的选择性和差异培养培养基，旨在通过乳糖发酵选择性分离革兰氏阴性菌和杆菌并对其进行分化。PPLO琼脂含有牛心脏灌注液和蛋白胨，以供应多形性、可过滤、挑剔的微生物生长所需的营养物质，这些微生物也缺乏坚硬的细胞壁，如支原体。Salmonella-Shigella.琼脂是一种选择性的、可用于分离、培养和分化的培养基沙门氏菌sp.和一些菌株志贺氏杆菌采用细菌学方法对菌落进行调查[20,21]。

统计方法

采用McNemar试验研究了消毒对减少鸵鸟蛋微生物污染的效果。将结果与卡方表的值进行比较，P<0.05认为显著[22]。

结果

所有接受测试的鸵鸟蛋或蛋壳都不含微生物。它们显示了广泛的微生物污染(表1)。46个鸡蛋被革兰氏阳性杆菌污染。其他细菌也很少被污染，例如:克雷伯氏菌spp在3个卵中;微球菌sp . 2个卵;大肠杆菌，表皮葡萄球菌，革兰氏阴性球菌，以及放射菌类每个都在鸡蛋里。识别出的真菌有:粘稠在17个鸡蛋中分别放入sp .和酵母;链格孢属种虫害和Helminthosporium.每卵6个;青霉菌spp在4个卵中;黄曲霉和曲霉属真菌nidulans每个鸡蛋3个;红酵母属spp。Partularia.种虫害和scopulariopsis.sp.每个在2个鸡蛋;和Allscheria和Curvularia每一种都盛在鸡蛋里。

微生物	鸵鸟的隔离次数 鸡蛋(全蛋%)
细菌
放射菌类	1 (1.6%)
大肠杆菌	1 (1.6%)
革兰阴性球杆菌	1 (1.6%)
革兰氏阳性杆菌	46（74.0％）
克雷伯氏菌spp。	3 (4.8%)
微球菌spp。	2 (3.2%)
葡萄球菌epidermidis	1 (1.6%)
菌类
Allscheria sp。	1 (1.6%)
链格孢属spp。	6 (9.6%)
黄曲霉	3 (4.8%)
曲霉属真菌nidulans	3 (4.8%)
Curvularia仕达屋优先计划．	1 (1.6%)
Helminthosporium.spp。	6 (9.6%)
粘稠spp。	17 (27.4%)
青霉菌spp。	4 (6.4%)
Partularia.spp。	2 (3.2%)
红酵母属spp。	2 (3.2%)
scopulariopsis.spp。	2 (3.2%)
酵母	17 (27.4%)

表1:从62个受污染的鸵鸟蛋壳中分离出细菌和真菌。

泄殖腔取样显示没有一只鸟被感染沙门氏菌，大部分污染是由于埃希氏杆菌属大肠杆菌．的一个案例克雷伯氏菌oxytoca其中一只鸡被检测出感染。交换一只成熟雌性鸵鸟的泄殖腔，由8号表示，呈现肠杆菌属agglomerans和大肠杆菌(表2)。

个人	Macconkey Agar.	Salmonella-Shigella. 琼那
1.小鸡	底片。	底片。
2.小鸡	底片。	底片。
3.小鸡	大肠杆菌	大肠杆菌
4.小鸡	大肠杆菌	大肠杆菌
小鸡	大肠杆菌	Klebsiellaxytoca.
6.小鸡	底片。	底片。
7.小鸡	底片。	底片。
* 8。成熟女性鸵鸟	大肠杆菌	肠杆菌属agglomerans

表2:从7只刚孵出的小鸡和一只成熟的雌性鸵鸟的泄殖腔中分离出的细菌*。
否定:负

在5种不育鸵鸟蛋的含量中，检测到真菌(如:粘稠种虫害和Helminthosporium.，但不含细菌(表3)。

不。鸵鸟蛋/培养基	MacConkey琼脂	血琼脂	Sabouraud的葡萄糖琼脂	营养琼脂	PPLO琼脂
1	底片。	底片。	底片。	底片。	底片。
2	底片。	底片。	Helminthosporium.spp。	底片。	底片。
3.	底片。	底片。	粘稠spp。	底片。	底片。
4	底片。	底片。	底片。	底片。	底片。
5	底片。	底片。	Helminthosporium.spp。	底片。	底片。

表3:从五个不育鸵鸟蛋的内容物中分离出微生物。
否定:负

革兰氏阳性杆菌,红酵母属spp。葡萄球菌epidermidis肺部的革兰氏阳性球菌;Helminthosporium.肝内革兰氏阳性杆菌;革兰氏阳性杆菌，革兰氏阳性球菌曲霉属真菌nidulans在大肠中;眼内革兰氏阳性杆菌;死亡胚胎的卵黄囊和心脏未见感染(表4)。

器官/文化 媒体	MacConkey琼脂	血琼脂	Sabouraud的右旋糖	营养琼脂	PPLO琼脂	Salmonella- shigella agar.
肺 否定:负	底片。	革兰氏阳性杆菌	红酵母属spp。	葡萄球菌epidermidis,革兰氏阳性杆菌，克-阳性球菌	底片。	底片。
肝	底片。	底片。	Helminthosporium.spp。	革兰氏阳性杆菌	底片。	底片。
大肠	底片。	革兰氏阳性杆菌	曲霉属真菌nidulans	革兰氏阳性杆菌，克-阳性球菌	底片。	底片。
眼睛	底片。	底片。	底片。	革兰氏阳性杆菌	底片。	底片。
卵黄囊	底片。	底片。	底片。	底片。	底片。	底片。
心	底片。	底片。	底片。	底片。	底片。	底片。

表4:从两个死亡胚胎的不同器官分离出微生物。

革兰氏阳性杆菌,链格孢属种虫害和粘稠来自setter机器的spp;革兰氏阳性杆菌,Helminthosporium.spp。来自孵化机;革兰氏阳性杆菌,粘稠spp。Helminthosporium.种虫害和曲霉属真菌nidulans从setter房间;革兰氏阳性杆菌,粘稠种虫害和链格孢属孵化室的spp;革兰氏阳性杆菌,粘稠种虫害和Helminthosporium.Spp.来自进气管道;革兰氏阳性杆菌,链格孢属种虫害和青霉菌从空气出口管道分离出sp.(表5)。

抽样位置/文化媒体	MacConkey琼脂	血琼脂	Sabouraud的葡萄糖琼脂	营养琼脂
设定机（拭子）	底片。	底片。	粘稠spp。	底片。
孵化机（拭子）	底片。	革兰氏阳性杆菌	Helminthosporium.spp。	革兰氏阳性杆菌
赛特机(有盖培养皿)	底片。	革兰氏阳性杆菌	链格孢属spp。	革兰氏阳性杆菌
孵化机(培养皿)	底片。	底片。	Helminthosporium.spp。	革兰氏阳性杆菌
Setter的房间	底片。	革兰氏阳性杆菌	粘稠spp。Helminthosporium.spp。 曲霉属真菌nidulans	革兰氏阳性杆菌
孵卵的房间	底片。	革兰氏阳性杆菌	粘稠spp。链格孢属spp。	革兰氏阳性杆菌
空气进气装置	底片。	革兰氏阳性杆菌	粘稠spp。Helminthosporium.spp。	革兰氏阳性杆菌
排气管道	底片。	革兰氏阳性杆菌	链格孢属spp。青霉菌spp。	革兰氏阳性杆菌

表5:从孵育室的不同部位分离出微生物
否定:负

芽孢杆菌spp。克雷伯氏菌spp。大肠杆菌,粘稠从紫花苜蓿中分离得到。豆粕中革兰氏阳性杆菌和酵母;GramnegativeCoccobacillius和粘稠麦麸中的spp;革兰氏阳性杆菌,粘稠spp。Helminthosporium.spp。曲霉属真菌nidulans,scopulariopsis.骨粉中的spp;粘稠玉米中的革兰氏阳性杆菌;粘稠spp。红酵母属和大麦中革兰氏阴性球菌;和粘稠spp。芽孢杆菌spp。,克雷伯氏菌混合日粮中发现的菌群(表6)。

饲料项目/文化媒体	细菌	菌类
大豆粉	革兰氏阳性杆菌	酵母
苜蓿	芽孢杆菌spp。大肠杆菌、克雷伯氏菌spp。	粘稠spp。
麦麸	革兰阴性球杆菌	粘稠spp。
骨粉	革兰氏阳性杆菌	粘稠spp。Helminthosporium.spp。曲霉属真菌nidulans，scopulariopsis.spp。
玉米	革兰氏阳性杆菌	粘稠spp。
大麦	革兰阴性球杆菌	粘稠spp。红酵母属spp。
混合饮食	芽孢杆菌,克雷伯氏菌spp。	粘稠spp。

表6:从饲料原料中分离出细菌。

农场的饮用水没有受到微生物污染。水的硬度为217 ppm，碱度为113 ppm, pH值为8。

甲醛气体消毒显著降低了营养琼脂和沙波罗氏琼脂中的细菌和真菌负荷(P<0.05)。这些结果表明，当微生物污染率较高时，用甲醛气体消毒是有用的(表7)。

	文化传媒
蛋壳消毒前后的微生物情况*	MacConkey琼脂	血琼脂	沙保弱琼脂	营养琼脂	PPLO琼脂
- / -	6	1	2	0	7
消极/积极	0	1	0	0	0
正负	4	7	6	8	3.
正/阳性	0	1	2	2	0
χ2 * *	2．25	3.12	4.16	6.12	1．33
P价值	0．13	0．07	0．04	0．01	0．24

表7：10个鸵鸟蛋甲醛气体消毒前后的微生物培养结果
*积极:增长;负面:没有增长
**麦克尼尔奇平方统计，Yates校正为1.0;χ²值超过表值3.841(在1自由度和0.05的alpha水平下)

讨论和结论

微生物污染可以从鸡蛋垂直或水平传递给鸡蛋。在垂直途径中，细菌可以在卵巢或输卵管中殖民，并且卵子被感染。虽然在我们的研究中，成熟女性泄殖腔中的分离微生物的类型和不孕蛋的含量不相似，但是，从女性鸟类生殖系统传播微生物污染的风险非常高。例如，蛋壳可以被污染沙门氏菌沥干输卵管或粪车[23]。在水平溃疡中，微生物可以通过环境污染蛋壳，例如粪便材料或灰尘，并感染膜和蛋黄[9]。由于孢子和抗旱性的形成，革兰氏阳性棒可以占据蛋壳微氯。据报道，一些机会毒细胞，如一些真菌，磨狼，革兰氏阴性肠道和革兰氏阴性发酵罐可以感染蛋含量[24,25]。如果环境条件适合于微生物生长，微生物可以在新鲜铺设的鸡蛋中迅速繁殖，并通过孔穿透蛋壳。最终，这种情况可能导致胚胎死亡和孵化率的减少[10]。

在科学报告中，芽孢杆菌spp。葡萄球菌spp。克雷伯氏菌spp。大肠杆菌,普罗透斯spp分离自克雷伯氏菌spp。大肠杆菌,普罗透斯从鸵鸟[26]的12个死胚中分离得到spp。葡萄球菌spp。也被发现在本研究中的死胚，和芽孢杆菌spp。克雷伯氏菌spp。,大肠杆菌存在于我们研究的蛋壳上。表4中存在的所有微生物也在表1中报告。因此，可以得出结论，通过蛋壳的污染已经渗透到卵中。在肺，肝脏，肠道和死亡胚胎的眼睛中检测到的革兰氏阳性杆菌也已经分离在农场的几乎所有区域，例如饲料成分（表5），孵化室，拆卸机器和潜水室的空气入口和空气出口管（表6）。不育卵中的污染物的存在可能是鸵鸟蛋早期胚胎死亡率高的原因[7]。

12个死去的鸵鸟胚胎。葡萄球菌spp。也被发现在本研究中的死胚，和芽孢杆菌spp。克雷伯氏菌spp。,大肠杆菌存在于我们研究的蛋壳上。表4中存在的所有微生物也在表1中报告。因此，可以得出结论，通过蛋壳的污染已经渗透到卵中。在肺，肝脏，肠道和死亡胚胎的眼睛中检测到的革兰氏阳性杆菌也已经分离在农场的几乎所有区域，例如饲料成分（表5），孵化室，拆卸机器和潜水室的空气入口和空气出口管（表6）。不育卵中的污染物的存在可以是鸵鸟蛋中早期胚胎死亡率的高速率的原因[8]。

认为DC[9]检测了鸵鸟蛋中的微生物污染。他报告了6例鸵鸟蛋壳真菌污染的案例，其中4例在本研究中被发现。以往的研究表明，细菌在鸡蛋污染中的作用比真菌更突出。然而，有人指出，鸡蛋的变质与蛋壳上的真菌的出现密切相关。真菌孢子几乎无处不在。真菌因其数量多、分布广、孢子释放快，可引起多种感染性疾病和中毒。鸡蛋对真菌的化学防御能力有限(例如，没有几丁质酶)。真菌能破坏外壳角质层。因此，细菌可以进入蛋壳的小孔，迅速进入卵内[11,29]。

有论文报道鸵鸟蛋没有角质层(Deeming, 1995)，也有研究者报道其存在[30]。因此，由于这种矛盾，有必要用预防方法将鸡蛋污染的可能性降到最低。在实验室条件下进行的研究表明，水的存在是微生物渗透到蛋壳的必要条件。因为水分会导致细菌在蛋壳上繁殖，通过渗透蛋壳孔隙，成为微生物传播的媒介[11,29]。因此，鸵鸟窝应该非常干燥，用颗粒状的垃圾覆盖，并定期清理灰尘。

在我们研究的农场中，鸡蛋被收集，农场的环境通常保持清洁。不幸的是，未进行孵化蛋的消毒，孵化室和培养箱机的消毒仅在繁殖季开始施用，并且没有疫苗接种。

由于增加了蛋壳孔隙中的扩散阻力，减少了气体交换，不建议清洗鸡蛋。此外，如果消毒液的温度低于鸡蛋的温度，鸡蛋的体积含量降低。这就造成了负压和真空，将细菌通过壳上的小孔移动到卵子内部，胚胎就受到感染[7,30]。因为使用的有用性的混合物permanganate-potassium福尔马林消毒鸵鸟蛋的问题是由于其强氧化特性[7],我们的研究结果显示,该方法的消毒是有利于减少微生物负载的蛋壳高污染。但在一个低的污染不是非常有效和可以忽略的一些措施和实践,实现环境卫生和个人卫生等如快速收集鸡蛋[31],维护巢卫生[32],认真收集和使用干布擦拭鸡蛋,把鸡蛋和无菌毛巾料[33]。

商品鸵鸟养殖场孵化蛋的平均孵化率为37.5% - 61.8%[6]。在商品养殖场，即使是很小的提高孵化率也会带来更多的经济效益，因此要千方百计地提高孵化率。因此，由于微生物污染在降低孵化率方面的作用和鸵鸟蛋中角质层存在的不确定性，必须在鸵鸟养殖场的所有地方保持严格的卫生标准。

确认

我们感谢莫哈斯®鸵鸟商业农场的经理和员工的帮助。作者感谢拉兹疫苗和血清生产研究所的合作和实验室设施。

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条信息

文章类型:研究文章

引用:Behnamifar A, Rahimi S, Akhavizadegan MA, Karimi Torshizi MA, Maleki A(2020)某商业鸵鸟养殖场鸡蛋中微生物的分离与鉴定。中国科学(d辑:地球科学

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出版的历史:

收到日期:01年7月，2020年

接受日期:2020年7月28日

发表日期:2020年8月04