摘要

瘤胃发酵可以被直接饲喂微生物(DFM)改变，尽管这些反应可能取决于DFM供应时间的长短。为了测试这个假说,12瘤胃插管安格斯引导(385±35公斤)是用于设计与晚稻饮食治疗,控制或DFM,整个情节,孵化媒体的治疗,控制或DFM在子图,和长度的饮食治疗(14至28 d)下级的阴谋。DFM主要为产乳酸菌的混合培养嗜酸乳杆菌和肠球菌都有效10点进食⁹cfu /天。精料比粗料为90:10，玉米饲粮日粮饲喂2次，用DFM或其乳糖载体追肥。培养基DFM剂量(50,000 cfu)提供与饲料中提供的每单位干物质相同的cfu。饲粮DFM降低产气量(P=0.02)，培养基DFM有降低产气量的趋势(P=0.06)。饲粮与培养基交互作用产气率(P<0.01);培养基DFM不添加添加DFM时降低，添加添加DFM时升高。挥发性脂肪酸(VFA)浓度随饲粮DFM的增加有降低趋势(P=0.07);而乙酸的摩尔比增加(P=0.01)。培养基DFM未改变(P≥0.21)发酵最终产物。日粮和饲粮DFM之间未观察到交互作用(P≥0.14)。 Differences in gas production and fermentation end products with dietary DFM suggest that DFM altered fermentation by shifting microbial populations, while interactions between diet and media suggest that DFM also have an immediate influence on the rumen environment.

关键字

Direct-fed微生物;体外天然气生产;挥发性脂肪酸;牛

介绍

由产乳酸菌(LAB)或乳酸菌与非乳酸菌的混合培养菌组成的直接饲喂微生物(DFM)可提高收货和育成阶段的增重和生长效率;然而，这些影响往往是短暂的，只发生在喂养的早期阶段[1-4]。目前，虽然提出的作用模式包括直接的抗菌作用，但介导这些变化的机制尚未确定通过细菌素、竞争性排斥和利用细菌[5]刺激乳酸。然而，饲粮中添加DFM已经表明会改变瘤胃发酵特性(即挥发性脂肪酸谱，pH)[6-9]。到目前为止，瘤胃环境对DFM供应随时间的变化的反应还没有被描述。饲料中添加DFM对瘤胃环境的影响可能会随着摄食期的不同而不同，饲料中添加DFM对瘤胃环境的影响也可能不同与一次给药到发酵容器中。这超出了简单的方法学考虑。了解DFM对瘤胃微生物区系的适应性，而不是直接效应，将有助于识别DFM在瘤胃中的作用机制。

通过模拟瘤胃环境在体外产气技术可以表征DFM介导的瘤胃变化。以前的在体外产气实验主要集中在提供酿酒酵母或酵母与各种乳酸菌菌株的组合的影响，并产生了不同的结果对产气和终点发酵最终产品的形成的影响[10-12];然而，关于细菌DFM对体外产气[2]影响的数据有限。这项研究旨在区分即时(在体外，用于发酵容器)和自适应(在活的有机体内，共消耗28 d)对瘤胃的影响在体外高浓缩底物的发酵，如产气和发酵最终产物的变化所示。

材料和方法

实验设计与处理

所有程序都由肯塔基大学动物护理和使用委员会批准。试验选用12头经瘤胃插管的安格斯阉牛(初始体重为385±35 kg)，进行劈裂-劈裂区设计试验(图1)。亚区由体外发酵罐和培养基DFM组成，亚区(亚区)内，时间在体外试验(14和28 d)，相对于开始添加DFM。

图1:实验设计。
^一个整个情节;牛饲粮中添加玉米粉载体(对照)或直接饲喂微生物的饲料或DFM;（10⁹cfu /天;10克，vite - men Co.， Norfolk, NE, USA)。
^b个细节;发酵容器添加乳糖载体(对照)或DFM，直接饲喂微生物;(50000 cfu;10克，vite - men Co.， Norfolk, NE, USA)。
^c相对于整块处理开始的取样日。

交错开始饲粮DFM处理，以确保只有3头牛作为瘤胃液供体在体外每个采样日(14天和28天)的产气量，结果是4个区块，每个区块3头阉牛。每天作为液体供体的阉牛数量的限制导致每个区块治疗的代表性不平等。处理被随机分配给动物，动物被随机分配到块，每个处理在每个块中表示。在体外在开始饲粮处理后的第14天和第28天测定产气量。这些采样天数是根据以往的研究选择的，在这些研究中，DFM对饲养性能的积极影响主要局限于饲喂的前28 d (Kenney et al.， 2015a, b)[13,14]。

阉牛被安置在独立围栏(3.0 × 3.7 m)内，免费供水，光照16小时，黑暗8小时。试验动物每天饲喂2次2.0 × NEm (NRC, 2000;表1)。TMR每周准备一次，并储存在冰箱(-20°C)中。每周测定成分干物质浓度，在混合下一负荷TMR之前，在强制空气烤箱(100°C, 1690型，VWR科学产品，Cornelius, OR)中干燥24小时。在26天内，通过使用两种过渡饲粮进行饮食适应。在开始处理前，动物适应最后的饲粮10天。从试验期第1天开始，在试验饲粮中添加DFM (10⁹Cfu /day)在玉米运输船或由玉米运输船组成的控制。DFM由混合细菌培养物组成，主要由嗜酸乳杆菌和肠球菌都有效但还包括片球菌属acidilacticii，短乳,乳杆菌(10克，vite - e - men Co.， Norfolk, NE, USA)。

	总混合配给
	升压饮食1	升压饮食2	最后的饮食
成分组成(克kg－１DM)
干燥谷物蒸馏器	200	200	200
玉米青贮饲料	200	125	50
紫花苜蓿青贮饲料	200	125	50
蒸汽精疲力竭的玉米	210	315	420
高水分玉米	90	135	180
地面玉米	68.8	68.8	68.8
石灰石	20.	20.	20.
矿物质预混料z	5．0	5．0	5．0
尿素	3．5	3．5	3．5
脂	2．5	2．5	2．5
维生素预混料y	0．2	0．2	0．2
硫胺素91%	０．００５	０．００５	０．００５
化学成分x(g公斤－１DM)
干物质	520	585	670
粗蛋白	161	156	151
乙醚萃取物	56	58	60
中性洗涤剂纤维	276	221	165
NEm, M大卡/千克	1.83	1.98	2．11

表1:总混合日粮成分组成。
^z微量矿物预混盐，不小于92%不大于96%，锌0.55%，铁0.93%，锰0.48%，铜0.18%，碘0.01%，硒0.01%，钴0.01% (2653L, Burkmann Feeds, Danville, KY)。
^y维生素预混-维生素A 1818,182 IU/kg，维生素D 363,000 IU/kg，维生素E 227 IU/kg。
^x化学组成代表公式值;喂食矿物质和维生素A、D和E。
为满足1.1 kg/d生长期肉牛的需求(NRC, 2000)

在体外天然气生产

每头牛提供瘤胃液用于6个发酵模块，每个子区处理3个重复。在晨饲前从每头牛的瘤胃腹部采集瘤胃内容物。按以下步骤为每只阉牛准备单独的培养基溶液。瘤胃内容物用浸泡搅拌器处理2分钟，通过4层粗棉布过滤。缓冲溶液、宏、微矿物溶液和还原溶液如前所述[15]。将这些溶液(1100 ml)与200 ml瘤胃液混合，将其作为培养基溶液添加到发酵容器中，并保持在CO下₂直到加入到250ml发酵容器中。发酵容器中添加底物400 mg (296 mg，干物质基础);基板由TMR冻结地面和Wiley磨组成，以通过1毫米筛管。此外，每个发酵罐注入2ml H₂O, 100毫升培养基溶液，1毫升培养基处理液。培养基处理为DFM +乳糖载体(50,000 cfu)或乳糖对照。培养基DFM用量与饲料提供给动物的每单位基质干物质的cfu相同。向容器中注入一氧化碳₂30秒，然后安装远程自动压力传感器(Ankom RF无线气体生产系统，Ankom技术，马其顿，纽约)。容器在39°C的水浴中培养30小时，每隔5分钟测量累积气体压力。初步工作表明，需要30小时的发酵才能达到平台，以便能够准确地模拟产气动力学。在发酵结束时，释放累积的气体，立即用便携式pH仪(Acorn pH 6 meter, Oakton Instruments, Vernon Hills, IL, USA)测定pH，并收集培养液样品。将5ml部分样品与0.5 ml偏磷酸(25 g/100 ml)和0.5 ml挥发性脂肪酸(VFA)内标(1 g/100 ml 2-乙基丁酸)结合，冷冻后进行分析。另一个5ml样品被冷冻，用于氨和dl -乳酸的分析。

样品分析

用气相色谱仪(6890 Hewlett-Packard, Avondale, PA, USA)测定培养液中VFA浓度，气相色谱仪安装在Supelco 25326 Nukol熔融石英毛细管柱(15 m × 0.53 mm × 0.05 um膜厚;Sigma/Supelco, Bellefonte, PA, USA)遵循之前描述的程序[16,17]。使用Konelab分析(Model 20XTi, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)测定NH_3.-N浓度以下步骤描述[18]。dl -乳酸通过气相色谱法(6890N型，Network GC, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)测定，随后衍生化培养液样品[19,20]¹³c -乳酸盐作为内标。

计算

每个培养瓶的顶空体积(206±4.7 mL)由总体积(水排量)减去培养基、基质和处理的添加量。利用理想气体定律将累积气体压力读数转换为气体体积。通过对10个产气模型[21]的评价，采用最佳拟合模型对单个模块的气体体积参数进行量化。最佳拟合模型为Fitzhugh模型(1±e)^{- rt}）ⁿ，它描述了气体体积随时间的函数。变量t表示时间，r和n为最小二乘拟合确定的速率参数。当n<0时使用上符号，当n<0时使用下符号。

统计分析

在体外使用GLM程序(SAS Inst. Inc.， Cary, NC)对产气模型输出(气体总量和产气速率)和发酵最终产品措施进行了劈裂-劈裂图设计分析。在统计分析之前，三个重复血管的值被编译为所有响应变量的平均值。以膳食处理为整块，培养基处理为亚块，与膳食处理起始日相关的天数为亚块。实验单位为:整块地的动物(n=6只/兆赫天)，子块的孵育容器(n=12只/兆赫天)，子块的孵育容器内的天(n=24只)。模型陈述包括饮食治疗，媒体治疗，块，天，和他们的相互作用的术语。考虑饲粮处理与阻断之间的互作以及饲粮处理、培养基处理与阻断之间的三种互作的随机效应，分别用于检验整体效应(饲粮处理)和子区效应(培养基处理)。剩余误差用于检测亚图因子(相对于开始饮食治疗的天数)。当交互作用显著时，用最不显著的差异分离平均值。差异有统计学意义(P<0.05)，在0.05<0.10有显著性趋势。

结果

在产气措施或发酵最终产物方面，饲粮处理、培养基处理和时间(天)之间未检测到3种交互作用(P≥0.35)。同样，在产气措施中，日粮和饲料或DFM处理(P>0.14)之间不存在相互作用。饲粮添加DFM处理降低了总产气量(P=0.02)(表2)。同样，培养基添加DFM处理也有降低总产气量的趋势(P=0.06)。从第14天到第28天，总产气量有增加趋势(P=0.06)。饲料DFM与培养基DFM交互作用对产气率的影响(P≤0.01)。在没有饲料DFM处理的情况下，培养基DFM处理降低了产气率。相反，当饲料中添加DFM时，培养基中DFM处理增加产气率(图2)。产气率从第14天到第28天增加(P=0.02)。

图2:直接投喂微生物对速效磷的影响在体外天然气生产^z．
^zSEM n = 12 /治疗
^y日粮处理由直接饲喂微生物(DFM)组成，主要由嗜酸乳杆菌和肠球菌都有效，以10的速率喂食⁹CFU/d或以乳糖为对照。
^x培养基处理包括直接饲喂微生物(DFM)，提供50,000 CFU/发酵罐或由乳糖组成的对照。

	饮食			媒体			一天			P值
	控制	DFMz	扫描电镜yx	控制	DFM	扫描电镜w	14	28	SEMv	饮食	媒体	一天
天然气生产
总,毫升u	148.6	131.1	5.45	143.2	136.5	5.45	132.6	147.1	5.29	0．02	0.07	0．06
率,1 /人力资源t	-	-	-	-	-	-	0.127	0.142	０．００５	0.79	0.49	0．02
总VFA,米米	80.86	72.26	2.16	77.37	75.76	1．16	81.79	71.33	1.76	0.07	０．４０	< 0.01
醋酸	41.92	39.42	1.03	40.96	40.39	0．65	44.75	36.60	0.96	0．18	0.58	< 0.01
丙酸	16.51	14.20	0.99	15.49	15.21	0．13	14.88	15.82	0.85	0．20	0．24	0．43
丁酸盐	12.32	10.02	0．50	11.53	11.11	0.22	12.66	9.98	0．43	０．０４	０．２６	< 0.01
摩尔比，mol/100 mol
醋酸	52.00	54.38	0.29	52.95	53.41	0．20	54.90	51.47	0．57	0．01	0．21	< 0.01
丙酸	20.27	19.89	0．80	20.11	20.01	0．14	18.16	22.00	0.89	0.76	０．７５	< 0.01
丁酸盐	15.63	13.71	0.81	14.75	14.59	0．08	15.40	13.94	0.54	0.19	０．２６	0．06
丙酸酯:	2.68	2.91	0．10	2.78	2.81	０．０４	3.09	2．50	0．11	0.19	0．63	< 0.01
DL-Lactate米米	0.071	0.070	0．002	0.070	0.070	0.003	0.036	0.104	0．002	0．48	0.96	< 0.01
NH3.- n m米	18.22	15.50	0.99	16.65	17.07	0.36	17.60	16.12	1.35	0．15	０．４７	0．43
pH值	6.38	6.46	0.03	6.42	6.42	0.003	6.30	6.54	0．02	0．13	0．31	< 0.01

表2:饲料和培养基直接饲喂微生物的用量和日用量对产气措施的影响在体外发酵结束的产品。
^zDFM:直接饲喂微生物，主要由嗜酸乳杆菌和屎肠球菌组成，饲喂109 cfu/d。
^ySEM:平均值的标准误差。
^xn = 12 /治疗。
^wn = 24 /治疗。
^vn = 24 /天。
^u总交互作用P≥0.39。
^t比率:饮食×培养基P=0.009(见图2)。

饲料处理与培养基处理之间未观察到交互作用(P≥0.18)。添加DFM有降低培养液VFA总浓度的趋势(P=0.07)(表2)。但饲料中添加DFM降低了(P=0.04)丁酸浓度。饲粮添加DFM可提高醋酸摩尔比例(P=0.01);而丙酸和丁酸的摩尔比例在饲粮DFM处理下无显著差异(P≥0.19)。饲粮处理对乙酸与丙酸的比例、dl -乳酸浓度、氨氮浓度和培养液pH无影响(P≥0.12)。

总VFA浓度(P=0.40)与培养基中添加DFM没有差异。培养基中添加DFM不影响(P≥0.26)乙酸、丙酸或丁酸浓度。同样，介质DFM处理对乙酸、丙酸和丁酸的摩尔比以及乙酸与丙酸的比例没有影响(P≥0.59)。培养基处理对dl -乳酸浓度、氨氮浓度和培养液pH均无影响(P≥0.31)。

从第14天到第28天，总VFA浓度下降(P=0.0002)。乙酸和丁酸浓度在第14 ~ 28天呈下降趋势(P≤0.0001)。丙酸浓度不受时间的影响(P=0.43)。第14 ~ 28天乙酸的摩尔比降低(P=0.0002)，丙酸的摩尔比增加(P=0.04)。丁酸的摩尔比随时间有降低趋势(P=0.06)。乙酸与丙酸的比例在第14 ~ 28天逐渐降低(P=0.0007)。dl -乳酸浓度随时间增加(P<0.0001)。时间对氨氮无显著影响(P=0.43)，但培养液pH在第14 ~ 28天显著升高(P<0.01)。

讨论

饲粮中添加DFM和产乳酸DFM的混合细菌培养物，主要由嗜酸乳杆菌和肠球菌都有效，导致天然气总产量下降;这表明饲喂该DFM[22]降低了底物降解程度，从而降低了瘤胃发酵程度。同时总VFA浓度也有降低的趋势，这进一步支持了饲粮DFM处理降低瘤胃发酵的效果。然而，可能是孵化开始时接种量的差异影响了孵化30小时后观察到的最终产物浓度。在另一份出版物中，我们报道了在活的有机体内在一项研究中，使用与本手稿[14]中报道的相同的瘤胃液接种物同时进行了DFM的效果。在该报告中，我们发现乙酸、丙酸、丁酸的浓度或总VFA在第14天和第28天没有显著差异。然而，本研究培养结束时总VFA浓度的数值差异(对照高11.9%)与初始接种浓度的差异(对照高12.6%)在比例上相似。

直接应用DFM也导致总产气量下降的趋势，尽管发酵最终产物没有变化。同样，Baah J等人的[2]观察到，与控制相比，随着注入量的增加，总产气量呈线性下降干酪乳杆菌和乳酸菌lactis12小时后在体外发酵;然而，发酵6、24和48 h时，总产气量没有观察到差异。相反，Jeyanathan和同事[23]观察到增加在体外若干细菌DFM菌株的总产气量。在这两种情况下，DFM处理均在发酵容器水平上使用，由饲喂普通饲粮的供牛提供瘤胃液，不使用DFM处理。

除总挥发性脂肪酸浓度有降低趋势外，饲粮DFM处理还导致丁酸浓度降低，乙酸摩尔比增加。与总VFA一起讨论，培养后丁酸浓度和乙酸摩尔比例的变化很大程度上是由于接种物初始条件的差异(分别报道[14])造成的。但随着乙酸摩尔比的增加，甲烷产量随DFM的增加而增加;然而，没有得到甲烷的直接测量。同样的,在体外在提供混合培养菌时，可以观察到乙酸的摩尔比例增加乳酸菌[2]。直接量度在体外大量细菌菌株产甲烷表明，不同菌株产甲烷不同(Jeyanathan et al.， 2016)[23]。醋酸盐比例的增加与之前的研究一致，这些研究表明体内丙酸菌属减少淀粉分解细菌数量，增加原生动物数量[6]。这种微生物种群的变化并不伴随着醋酸盐摩尔比的变化;然而，醋酸的摩尔比例却有所增加在活的有机体内提供丙酸菌属结合肠球菌都有效［6］．这与Baah J和同事[2]的研究结果一致，在发酵12、24和48 h后，随着DFM添加量的增加，乙酸与丙酸的比例呈线性增加。氨氮与DFM没有差异，这与先前发现的微生物氮与DFM提供没有差异的研究一致在体外[2]。

随着饲粮添加DFM，发酵最终产物发生变化，而在体外培养基中添加DFM对发酵最终产物没有影响。这表明，DFM可能通过诱导瘤胃微生物生态的变化来改变瘤胃发酵。有文献证明，随着细菌DFM[6]的提供，微生物种群的变化支持了这一假设。然而，DFM在培养基上的应用有降低总产气率的趋势，总产气率是基质降解程度的代理指标，并且在接种剂处理和培养基处理之间观察到产气率的相互作用。DFM在培养基上的应用对产气速率的影响取决于膳食处理。在饲料中没有DFM的情况下，培养基中DFM处理导致产气率下降。相反，当添加DFM时，介质的DFM处理导致速率增加。这表明，DFM处理供体液中的微生物与微生物种群相互作用，或以其他方式改变了瘤胃环境，提高了消化率，但有降低降解程度的趋势。在没有添加DFM处理的情况下，DFM处理培养基会导致消化率降低，降解程度也有降低的趋势。这些相互作用所通过的机制是未知的。 Ultimately, these results suggest that在体外使用未经处理的动物的供瘤胃液并直接向培养基提供处理液的产气实验可能不适用于研究DFM。

无论DFM供应情况如何，总产气量都有随时间增加的趋势，而且产气量也有增加的趋势。从第14天到第28天，总挥发性脂肪酸浓度下降。通常，挥发性脂肪酸浓度的增加将伴随产气量的增加。虽然很难解释，但这种减少可能是由于微生物生物量[24]中VFA碳的微生物固存增加所致。气体产量的增加可能是微生物生长增加的作用，因此增加了微生物种群的能量需求，从而导致更多的碳利用。从第14天到第28天，乙酸和丁酸浓度降低，而丙酸浓度保持不变。结果表明，丙酸的摩尔比以乙酸和丁酸的牺牲为代价而增加，因此乙酸与丙酸的比例降低。在第28天观察到dl -乳酸浓度增加，这可能是由于乳酸通过丙烯酸酯途径[25]作为丙酸生成的中间体。从第14天到第28天，培养液pH升高，可能是由于总VFA浓度降低。虽然dl -乳酸在第28天增加，通常伴随着pH的下降，但这种增加与总VFA的下降相比很小。

结论

直接喂养的微生物改变在体外这证实了之前的工作，表明了DFM在瘤胃发酵中的变化[6,7,9,26]。供体动物添加DFM后，总产气量和发酵最终产物发生改变，表明DFM通过改变微生物种群来改变瘤胃发酵，或通过其他方式改变瘤胃环境;然而，接种物和培养基处理之间的相互作用表明，DFM对瘤胃环境也有更直接的影响。需要进行更多的研究来确定这些关系的性质。

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条信息

文章类型:研究文章

引用:Kenney NM, Vanzant ES, Harmon DL, McLeod KR(2020)直接喂养微生物改变瘤胃在体外高浓缩饲料的气体生产和发酵。中国科学(d辑:地球科学

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出版的历史:

收到日期:2020年1月22日

接受日期:2020年2月24日(

发表日期:2020年2月28日(